從台灣的中央研究院轉戰來到哈佛醫學院，老闆給我的第一個任務，毫不意外的就是建立一隻新的基因轉殖小鼠。基於學術機密的考量，遇到敏感的關鍵字我會用ABC...帶過，你也不用問我這ABC...代表什麼，因為在這我也不能講。我只是分享我遇到的新鮮事和抒發實戰感想而已，就多包涵了！

要做基因轉殖小鼠，說來話長，反正『沒有三兩三，真的不能上梁山』！這幾年技術突飛猛進：

（1）原核鼠胚基因注射 (pronuclear microinjection)：打一定劑量的促進排卵激素後，讓母鼠進洞房。隔天有愛的記印的新婚母鼠就犧牲來取受精卵（真是煞風景）；在顯微鏡下用玻璃針將欲表現的DNA打到還是單細胞的鼠胚原河內（此時它還沒發育神經，所以應該還不會痛啦！）收集幾百顆挨針的鼠胚，通常會先在培養皿裡養個24小時，隔天挑外表健康的胚移植到代理孕母的輸卵管裡；所謂的代理孕母，就是同步和已經結紮輸精管的公鼠交配過的母鼠，確保此時子宮內的環境適合鼠胚著床。28天後出生的小寶寶裡面就會有帶這DNA的小傢伙出現啦！這個方法的優點是快，但是缺點很嚴重，因為插進染色體內的DNA其數量（cpoy number）無法控制，插進染色體的位置更是隨機發生，所以有些子代雖然有帶這DNA，會不會表現、表現多少和表現位置都不一樣，這就是DNA亂插造成的位置效果（position effect）。

         
   

（2）鼠胚幹細胞同源互換(ES cell homologous recombination)：基因標的(gene targeting)，是劃時代的生物學術成就，也是2007年 Mario Capecchi獲頒諾貝爾獎的原因。小鼠的受精卵在子宮著床發育幾天後就進入了囊胚(blastocyte)時期，囊胚裡面有很多的祖先細胞（或稱幹細胞：embryonic stem cell），就是之後發育成為各種『體細胞』的祖先。過去十幾年來，科學家努力發展讓這些幹細胞維持原狀或分化為特定體細胞的培養技術，這些技術最棒的應用之一就是用來進行特定基因的剔除或轉殖。要剔除或置換特定的基因，你需要先拿到這基因的基因組(genomic) DNA，利用各種克隆技術剪出兩段同源DNA片段，夾在『塞選基因』的兩側。馬力歐有多聰明，他用了兩種塞選基因(selection gene)來大幅提升同源DNA互換的機率：（1）沒我你會死(positive selection)的抗藥基因和；（2）有我你會死的毒素(negative selection)基因。以圖例來說明：同源基因的重組互換在幹細胞內會自然發生，但是機率很低，為了增加正確基因重組的機率，我們把抗藥基因(neo resistent gene)放在兩段同源DNA片段的中間，也就是說，沒成功同源互換的幹細胞們在加入抗生素的培養皿中會慢慢凋亡，能存活就兩種：成功同源互換本尊或是整段亂插進體染色體的冒牌貨；為了幹掉這些冒牌貨，我們在載體末頭端放了毒素基因，冒牌貨帶了毒素基因自然就掛了，剩下存活在培養皿的就是成功進行同源DNA互換的模範生了。



挑到這些模範生，就可以將這些模範生幹細胞打回去另一品系（毛色不同）的小鼠囊胚裡，因為幹細胞會分化成體細胞，而且總是有機會分化成生殖腺（睪丸）內的精母細胞，一旦精母細胞帶上這同源互換的基因片段，它就會自然而然透過精子受精傳給下一代。因為囊胚內的幹細胞有兩種，這種老鼠幹細胞混雜的囊胚生出來就變成小花鼠(chimera)。多配幾隻小花鼠，越花越好，你總會有機會得到全身帶有互換基因的純種子代，這隻就是你的基因剔除小鼠，他全身的體細胞都帶著你成功置換的基因片段呢！看到這裡，你是否也和我一樣對馬力歐豎起大拇指，獲頒諾貝爾獎真是實至名歸呢！讓我們繼續看下去.......







































（3）RNA導彈式基因切割酵素(CRISPR-Cas9)：眼尖的人都看得出來，這種幹細胞同源互換的裝配生產線解決的copy number和position effect的問題，但不但費時而且耗工，加上不是所有物種的幹細胞都像小鼠這麼容易培養或取得。這幾年，另一個劃時代的基因改造技術出現了，就是CRISPR-Cas9 。RNA-導彈式基因切割酵素的發現起源於細菌對抗病毒入侵的研究，和人體的免疫系統一樣，我們身體一旦被某種流感病毒肆虐過，我們的免疫細胞就會記得這當年蹂躪過我的病毒壞蛋。細菌也有自己的一套機制，來確保自己不會被同一病毒壞蛋蹂躪第二次。加州柏克萊大學的 Jennifer Doudna發現：DNA切割酵素Cas9 會利用RNA小片段序列（通常就是外來病毒的小片段基因序列）來當導彈，專一性的攻擊以前欺負過我的病毒DNA。利用這DNA切割酵素，科學家給予Cas9配備特定基因序列的RNA導彈，Cas9就會去切割染色體內核酸序列完全相符的位置。別小看切這一刀，這一刀會引發細胞內自行修復DNA斷裂的機制來處理這斷掉的DNA，修理的過程中會造成突變（NHEJ: Nonhomology end jointing）或同源DNA互換（HDR: homology direct repair 如果你同時給予同源雙臂的外來DNA），其結果就是小片段RNA-導彈標定位置的DNA序列被改變或重組。所以，現在要做一隻基因剔除小鼠，只要選對DNA標定序列，在試管內合成對應的序列RNA，將cas9和這合成的導彈RNA一起打入老鼠原核胚或生殖細胞內，產出得子代裡面就會有基因改造的小鼠出現。大家有機會可以去看看 Jennifer Doudna 在YouTube的很多場演講，不管這技術的商標官司最後結果怎判，我相信 Jenifer 一定會是明年諾貝爾獎的熱門人選。

（4）DNA導彈式基因切割酵素：RNA還要再試管內合成，最近河北科技大學的韓春雨教授找到了類似但卻是用小片段DNA序列來做導彈的基因切割酵素，這文章發表在今年五月的Nature Biotechnology，真是中國人之光，在這一定要吹噓一下。有興趣的朋友可以去找來看看！這發現雖然沒辦法角逐諾貝爾獎，但韓春雨老師這輩子的吃穿應該都不是問題了，哈哈！

參考文獻與圖表引用出處


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